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Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题

发布时间 2020-02-10 BY 阅读 238次

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种实验室常用的检测方法,广泛应用于测量溶液中的分析物(抗体或抗原)的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是,酶联免疫吸附试验或酶免疫测定(EIA)通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤,实现特异性和非特异性相互作用的分离,并可通过最终有色产物的形成,定量分析原始样品中分析物的含量。

 

ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂:固相的抗原或抗体;酶标记的抗原或抗体;酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源,可设计出不同类型的ELISA检测方法。

 

该实验可迅速分析大量平行样品,在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。

 

一、直接ELISA

原理:将抗原与固相载体连接,洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。

优点:操作流程简短,实验步骤少;无需使用二抗,避免了交叉反应;实验步骤少,操作不易出错。

 

缺点:实验中的一抗需要直接用酶标记,成本相对较高。

 

二、间接法ELISA

原理:将抗原与固相载体相连结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,加底物显色。 

优点:酶标二抗可加强信号,提高灵敏度;灵活性更大,同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗;不直标一抗,可保留更多的免疫反应性;成本更低,使用标记抗体更少。

 

缺点:交叉反应几率升高。

 

三、双抗夹心法ELISA

原理:双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子,但不适用于小分子抗原。将特异性抗体(捕获抗体)与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品,保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体(检测抗体)保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。

 

双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。

 

优点:高特异性,使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的;适用于复杂样品,抗原不需要进行纯化即可用于检测;灵活性更大,灵敏度更高,可采用直接法也可采用间接法。

缺点:检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位;不适用于检测小分子物质。

 

四、竞争法ELISA

原理:竞争法ELISA最为复杂,通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体,当样品中的游离抗原越多,就可结合越多的抗体,而固相抗原只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物,只留下固相抗原与抗体的结合物。显示经计算可得样品中抗原的含量。竞争法可根据实验设置直接法、间接法或夹心法形式。

常见问题

Elisa 实验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。

 

下面一步步分析Elisa试验操作中可能影响结果因素。

Step1: 标本的选择与准备

用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(),有时因为特定的检测目的,也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集,要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨46点之间,会有一峰值出现:生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式释放,因此,在测定此类激素时,有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本,以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时,血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测,应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响,只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面:

(1)要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团,其有类似过氧化物的活性,因此,在以HRP为标记酶的ELISA测定中,如血清标本中血红蛋白浓度较高,则其就很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色。

(2)样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染,一则细菌的生长,其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

(3)血清标本如是以无菌操作分离,则可以在28下保存一周,如为有菌操作,则建议冰冻保存。样本的长时间保存,应在-70℃以下。

(4)冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用,从而引起假阴性结果。此外,冻融标本的混匀亦应注意,不要进行剧烈振荡,反复颠倒混匀即可。

(5)标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时,应离心沉淀后取上清检测。

 

Step2: 试剂的准备

在临床实验室,对试剂准备一般不太注意,通常的做法是,在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,在实验开始前,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置30-60分钟,再进行测定,以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的,主要是为了在后面的温育反应步骤中,能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度,以满足测定要求。

 

Step3: 加样

1) 标本为血清:最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次,放置一段时间后,3000rpm离心15分钟;若在几天内检测,可放在2-8冰箱中,若要贮存,则置于-20℃的低温冰箱内。

2)加样后及时放入孵箱。 

3)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4)如果采用AT或其他全自动加样,最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 

5)标本较多时,请分批操作。

6)血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是:加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。

 

Step4: 孵育

1)温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比,即温度越高,则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37和室温,其次是43℃28。按照操作说明严格控制孵育时间;

2)孵育时贴封片或加盖,避免标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁。

 

Step5:洗板

保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;反应板过多时,合理安排,或多用几台洗板机,避免等待时间过长。


Step6: 显色

显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用; 加样时保持显色剂不外流。

 

Step7: 终止

在加终止液时应避免产生气泡,而导致假阳性结果。

 

Step8: 读板

整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;尽可能实现ELISA检测标准自动化,有效提高检测质量。

 

在实际操作中,除了选择优良试剂外,必须严格按照操作步骤进行操作,同时作好室内质控、室间质评,以严谨的工作作风检测每一份标本,才能保证检测质量。

 

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