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ELISA检测方法

发布时间 2020-02-10 BY 阅读 66次

ELISA酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

基本原理

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性

使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。

在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

双抗夹心法

夹心法常用于检测大分子抗原,一般的操作步骤为:

将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体;

加入待测检体,检体中若含有待测的抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结;

洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一的一次抗体,与待测抗原进行键结;

洗去多余未键结一次抗体,加入带有酶的二次抗体,与一次抗体键结;

洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果。

间接法

间接法常用于检测抗体,一般的操作步骤为:

将已知的抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余的抗原。

加入待测检体,检体中若含有待测的一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。

洗去多余待测检体,加入带有酶的二次抗体,与待测的一次抗体键结。

洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酶呈色,藉仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。


竞争法

竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:

将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体;

加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结;

加入带有酶的抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。

洗去检体与带有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少,显色也就越浅。

注:当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA




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